/ ОФС / 27. Бактериальные эндотоксины. Лал теста


ЛАЛ-тест « BelFarmLab

Основным показателем качества воды, применяемой для приготовления инъекционных/инфузионных растворов является апирогенность.

Термин «пироген» происходит от греческого “pyreto” – лихорадка. Пирогенами называют вещества, способные вызывать повышение температуры тела при попадании в кровь. К ним относят: грамотрицательные бактерии и их токсины, вирусы и продукты их жизнедеятельности, погибшие микробные клетки и пр. По химическому составу пирогенные вещества представляют собой липополисахаридные или липополисахаридно-протеиновые комплексы  наружных мембран  грамотрицательных бактерий, так называемые – бактериальные эндотоксины.

Пирогенные вещества – это высокомолекулярные соединения, они нелетучи и не перегоняются с водяным паром.  Загрязнение дистиллированной воды пирогенными веществами происходит чаще всего в результате переброса капельной фазы, содержащей пирогенные вещества, из испарителя в конденсатор и сборник аквадистиллятора.

Поэтому главной задачей при получении воды для инъекций является отделение капелек воды от паровой фазы, уменьшение толщины кипящего слоя, обеспечение равномерного кипения и оптимальной скорости парообразования.

Пирогены  – термостабильные вещества, они разрушаются только при нагревании в суховоздушных стерилизаторах при температуре 250°С в течение 30 минут. При воздействии пара под давлением (t 120°С автоклавированием) в растворах пирогены разрушаются только через 5 часов.  Следовательно, освободиться от пирогенных веществ в воде и инъекционных растворах при помощи термической стерилизации практически невозможно.

Таким образом, каждый инъекционный раствор после его правильной стерилизации стерилен, но не каждый стерильный раствор – апирогенен.

Стерильность и  апирогенность – разные понятия и подменять одно другим – нельзя.

Отсюда ясна важность строжайшего соблюдения аптечным учреждением асептических условий изготовления инъекционных растворов на всех этапах, независимо от последующей стерилизации.

Существует химический метод депирогенизации (очистки от пирогенных веществ) – это выдерживание в подкисленном кислотой серной 0,5% -1% растворе калия перманганата в течение 25-30 минут (метод используется для обработки стеклянных соединительных трубок и сосудов), согласно приказа МЗ РФ № 309 от 21.10.1997г. «Инструкция по санитарному режиму аптечных организаций (аптек)».

В связи с опасностью пирогенного эффекта проверке на «Пирогенность» должны подвергаться растворы, вводимые внутривенно в объемах 10 мл и более (ГФ ХI).

По фармакопейной методике (ГФ ХI) пирогенность определяется с помощью биологического метода, основанного на изменении температуры тела кролика после введения испытуемых препаратов. Для этого исследуемый раствор препарата или 0,9% изотонический раствор натрия хлорида, приготовленный  на испытуемой воде, вводят трем кроликам, в ушную вену из расчета 10 мл на 1 кг веса кролика. Раствор лекарственного вещества или воду считают апирогенными, если в каждом из трех измерений температура тела кролика не должна повышаться более, чем на 0,6 °С, а в сумме не должна превышать 1,4 °С. Относительная чувствительность в данном случае составляет 1 – 10 нг/мл.

Недостатки биологического метода: зависимость результатов от индивидуальной чувствительности животного, большее восприятие пирогенной реакции человеком по сравнению с кроликом и высокие затраты на содержание и уход за животными (метод экономически дорог).

Фармакопея США ХХ (1980г.)  включила  наряду с испытаниями на кроликах определение пирогенных веществ с помощи реакции гелирования лизата амебоцитов крови (гемолимфы) мечехвоста  вида Limulus polyphemus.

В 1964 г. в США было доказано, что клетки крови мечехвоста  вида Limulus polyphemus  способны специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий (пирогенами). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина в испытуемом растворе.

Поскольку первые исследования были проведены на мечехвостах, препарат, полученный из их крови, был назван Лизат амебоцитов Limulus (Limulus amebocyte lysate), сокращенно ЛАЛ-реактив, и, соответственно, ЛАЛ-тест.

ЛАЛ-реактив представляет собой лиофильно высушенный препарат. Это водный экстракт (лизат) амебоцитов, содержащий все компоненты, необходимые для реакции с эндотоксином.

Для проведения анализа методом гель-тромб тест предназначены ЛАЛ-реактивы Endosafe и Endosafe KTA.

Фармакопея Японии, Европейская Фармакопея также включили наряду с биологическим методом определение пирогенных веществ с помощи реакции гелирования лизата амебоцитов крови мечехвоста.

На основе вышеуказанной реакции гелирования разработан активно развивающийся способ контроля  качества лекарственных средств, определяющий наличие бактериальных эндотоксинов  in vitro – ЛАЛ-тест.

И сегодня ЛАЛ-тест считается наиболее надежным  и перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных средств.

Преимущества этого теста – высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, хорошая воспроизводимость, возможность анализировать в короткий срок большое число образцов.

При массовом использовании этот метод, безусловно, дешевле теста на кроликах.

Опубликовано 7 июня 2010

belfarmlab.ru

Лал Тест - Центр контроля качества и сертификации ЛС

Основным показателем качества воды, применяемой для приготовления инъекционных/инфузионных растворов является апирогенность.

Термин «пироген» происходит от греческого “pyreto” – лихорадка. Пирогенами называют вещества, способные вызывать повышение температуры тела при попадании в кровь. К ним относят: грамотрицательные бактерии и их токсины, вирусы и продукты их жизнедеятельности, погибшие микробные клетки и пр. По химическому составу пирогенные вещества представляют собой липополисахаридные или липополисахаридно-протеиновые комплексы  наружных мембран  грамотрицательных бактерий, так называемые – бактериальные эндотоксины.

Пирогенные вещества – это высокомолекулярные соединения, они нелетучи и не перегоняются с водяным паром.  Загрязнение дистиллированной воды пирогенными веществами происходит чаще всего в результате переброса капельной фазы, содержащей пирогенные вещества, из испарителя в конденсатор и сборник аквадистиллятора.

Поэтому главной задачей при получении воды для инъекций является отделение капелек воды от паровой фазы, уменьшение толщины кипящего слоя, обеспечение равномерного кипения и оптимальной скорости парообразования.

Пирогены  – термостабильные вещества, они разрушаются только при нагревании в суховоздушных стерилизаторах при температуре 250°С в течение 30 минут. При воздействии пара под давлением (t 120°С автоклавированием) в растворах пирогены разрушаются только через 5 часов.  Следовательно, освободиться от пирогенных веществ в воде и инъекционных растворах при помощи термической стерилизации практически невозможно.

Таким образом, каждый инъекционный раствор после его правильной стерилизации стерилен, но не каждый стерильный раствор – апирогенен.

Стерильность и  апирогенность – разные понятия и подменять одно другим – нельзя.

Отсюда ясна важность строжайшего соблюдения аптечным учреждением асептических условий изготовления инъекционных растворов на всех этапах, независимо от последующей стерилизации.

Существует химический метод депирогенизации (очистки от пирогенных веществ) – это выдерживание в подкисленном кислотой серной 0,5% -1% растворе калия перманганата в течение 25-30 минут (метод используется для обработки стеклянных соединительных трубок и сосудов), согласно приказа МЗ РФ № 309 от 21.10.1997г. «Инструкция по санитарному режиму аптечных организаций (аптек)».

В связи с опасностью пирогенного эффекта проверке на «Пирогенность» должны подвергаться растворы, вводимые внутривенно в объемах 10 мл и более (ГФ ХI).

По фармакопейной методике (ГФ ХI) пирогенность определяется с помощью биологического метода, основанного на изменении температуры тела кролика после введения испытуемых препаратов. Для этого исследуемый раствор препарата или 0,9% изотонический раствор натрия хлорида, приготовленный  на испытуемой воде, вводят трем кроликам, в ушную вену из расчета 10 мл на 1 кг веса кролика. Раствор лекарственного вещества или воду считают апирогенными, если в каждом из трех измерений температура тела кролика не должна повышаться более, чем на 0,6 °С, а в сумме не должна превышать 1,4 °С. Относительная чувствительность в данном случае составляет 1 – 10 нг/мл.

Недостатки биологического метода: зависимость результатов от индивидуальной чувствительности животного, большее восприятие пирогенной реакции человеком по сравнению с кроликом и высокие затраты на содержание и уход за животными (метод экономически дорог).

Фармакопея США ХХ (1980г.)  включила  наряду с испытаниями на кроликах определение пирогенных веществ с помощи реакции гелирования лизата амебоцитов крови (гемолимфы) мечехвоста  вида Limulus polyphemus.

В 1964 г. в США было доказано, что клетки крови мечехвоста  вида Limulus polyphemus  способны специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий (пирогенами). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина в испытуемом растворе.

Поскольку первые исследования были проведены на мечехвостах, препарат, полученный из их крови, был назван Лизат амебоцитов Limulus (Limulus amebocyte lysate), сокращенно ЛАЛ-реактив, и, соответственно, ЛАЛ-тест.

ЛАЛ-реактив представляет собой лиофильно высушенный препарат. Это водный экстракт (лизат) амебоцитов, содержащий все компоненты, необходимые для реакции с эндотоксином.

Для проведения анализа методом гель-тромб тест предназначены ЛАЛ-реактивы Endosafe и Endosafe KTA.

Фармакопея Японии, Европейская Фармакопея также включили наряду с биологическим методом определение пирогенных веществ с помощи реакции гелирования лизата амебоцитов крови мечехвоста.

На основе вышеуказанной реакции гелирования разработан активно развивающийся способ контроля  качества лекарственных средств, определяющий наличие бактериальных эндотоксинов  in vitro – ЛАЛ-тест.

И сегодня ЛАЛ-тест считается наиболее надежным  и перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных средств.

Преимущества этого теста – высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, хорошая воспроизводимость, возможность анализировать в короткий срок большое число образцов.

При массовом использовании этот метод, безусловно, дешевле теста на кроликах.

 

ckkls.belzdrav.ru

27. Бактериальные эндотоксины

27. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ (ОФС 42-0062-07)

Настоящая статья описывает метод определения бактериальных эндотоксинов в лекарственных препаратах, предназначенных для парентерального применения, и субстанциях, используемых для их изготовления.

Определение содержания бактериальных эндотоксинов проводят с помощью реактива, представляющего собой лизат клеток крови (амебоцитов) мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛ-реактив) или Tachypleus tridentatus (ТАЛ-реактив). В результате реакции с эндотоксином происходит помутнение реакционной смеси и увеличение ее вязкости вплоть до формирования плотного геля, образование которого служит индикатором наличия в пробе бактериальных эндотоксинов. Проводимый таким образом анализ называется гель-тромб тест. Этот метод может быть использован для определения соответствия содержания бактериальных эндотоксинов предельному содержанию бактериальных эндотоксинов, указанному в частной фармакопейной статье («Метод А. Качественный анализ»), и для определения содержания бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве («Метод В. Количественный анализ»).

Качественный анализ является основным методом проведения анализа на соответствие показателю «Бактериальные эндотоксины». Этот же метод является арбитражным.

Допускается использование других методов и/или модификаций ЛАЛ-теста, если они указаны в частной фармакопейной статье и валидированы для данного лекарственного средства.

Посуда и ее подготовка

Стеклянная и пластиковая посуда, используемая в ЛАЛ-тесте, не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должна оказывать влияния на ход реакции.

Рекомендуемым режимом депирогенизации является нагревание при температуре 250 °С не менее 30 мин в соответствии с валидированной процедурой.

Стандарты эндотоксина

Содержание бактериальных эндотоксинов выражается в единицах эндотоксина (ЕЭ) Международного стандарта эндотоксина. При проведении анализа может использоваться Контрольный стандарт эндотоксина (КСЭ) активность которого установлена по Международному стандарту эндотоксина.

Контрольный стандарт эндотоксина должен быть предназначен для проведения анализа с данной партией ЛАЛ-реактива (ТАЛ-реактива)1. Растворение и хранение КСЭ осуществляют согласно инструкции фирмы-производителя.

ЛАЛ-реактив

Необходимо использовать ЛАЛ-реактив, предназначенный для проведения фармакопейного анализа с помощью гель-тромб теста. В случае проведения анализа методом, отличным от основного, необходимо использовать реактив, предназначенный для данного метода.

Чувствительность реактива (λ) выражена в единицах эндотоксина [ЕЭ/мл] и соответствует минимальной концентрации Международного стандарта

1 Контрольный стандарт эндотоксина и ЛАЛ-реактив или ТАЛ-реактив должны быть зарегистрированы в Минздравсоцраз-

вития РФ.

эндотоксина, которая вызывает образование плотного геля при реакции с данным реактивом.

ЛАЛ-реактив представляет собой лиофилизированный препарат. Растворение и хранение реактива осуществляют согласно инструкции фирмы-производителя.

Вода для ЛАЛ-теста

Для приготовления растворов реактивов и разведений испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста. Вода для ЛАЛ-теста должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде для инъекций, и при этом не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте.

Максимально допустимое разведение испытуемого лекарственного средства

Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого лекарственного средства, в котором возможно определение концентрации эндотоксина, соответствующей значению предельного содержания бактериальных эндотоксинов, установленному для данного лекарственного средства.

Испытуемое лекарственное средство может быть проверено в одном разведении или в серии разведений при условии, что конечная степень разведения не превысит значения МДР, которое рассчитывается по формуле:

где:

предельное содержание бактериальных эндотоксинов – допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, указанное в частной фармакопейной статье;

концентрация испытуемого раствора – концентрация лекарственного средства или действующего вещества, для которого указано предельное содержание бактериальных эндотоксинов;

λ – чувствительность ЛАЛ-реактива [ЕЭ/мл].

Для расчета предельного содержания бактериальных эндотоксинов используют следующую формулу:

Предельное содержание бактериальных эндотоксинов = ,

где:

М – максимальная терапевтическая доза испытуемого лекарственного средства, вводимая в течение одного ч (в мг, мл, ЕД на 1 кг массы тела). Дозу, выраженную на 1 м2, пересчитывают с учетом того, что поверхность человека со средней массой тела 70 кг составляет 1,8 м2;

К – пороговая пирогенная доза, равная 5 ЕЭ/кг в 1 ч для испытуемого лекарственного препарата, если он вводится пациенту любым парентеральным путем, кроме интратекального. При интратекальном пути введения лекарственного препарата К составляет 0,2 ЕЭ/кг.

Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых парентерально (внутривенно), предельное содержание бактериальных эндотоксинов рассчитывается, как 175/V, где V – максимальная рекомендованная доза в мл. Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых интратекально, предельное содержание бактериальных эндотоксинов равняется 14/V.

Для субстанций рассчитывают предельное содержание бактериальных эндотоксинов, используя величину М, выбранную для лекарственной формы.

Подготовка испытуемого образца

Каждый отобранный образец испытывается индивидуально.

Для растворения и/или разведения испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста, если не указано иного в частной фармакопейной статье. Испытуемый раствор должен иметь рН в пределах, указанных производителем ЛАЛ-реактива, обычно 6,0-8,0. В случае необходимости рН доводят растворами кислоты, основания или с помощью буферного раствора. Используемые растворы не должны содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должны оказывать влияния на ход реакции.

Процедура анализа

В круглодонные пробирки диаметром 10 мм вносят равные объемы ЛАЛ-реактива и испытуемого раствора (по 0,1 мл). Реакционные смеси аккуратно перемешивают и инкубируют при температуре 37 ± 1 °С в течение 60 ± 2 мин. Во время инкубирования следует избегать вибрации и ударов. По истечении указанного срока визуально регистрируют результаты как положительные или отрицательные. Положительная реакция (+) характеризуется образованием плотного геля, который не разрушается при аккуратном однократном переворачивании пробирки на 180°. Отрицательная реакция (–) характеризуется отсутствием такого геля.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ

Для подтверждения достоверности и точности результатов определения бактериальных эндотоксинов, проводимых с помощью ЛАЛ-реактива, необходимо подтвердить чувствительность реактива, указанную на этикетке, а также убедиться в том, что испытуемое лекарственное средство не содержит факторов, мешающих проведению реакции.

Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива

Анализ проводят для каждой новой серии используемого ЛАЛ-реактива, а также при изменении условий эксперимента, используемых материалов и реактивов, способных повлиять на результаты теста.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы C и D по схеме, приведенной в табл. 27.1.

Таблица 27.1

Схема эксперимента

«Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива»

Раствор

Исходный раствор

Растворитель

Фактор разведения

Конечная кон- центрация КСЭ в испытуемом растворе

Количество повторностей

С

Раствор КСЭ в воде для ЛАЛ-теста

с концентрацией 2λ

Вода для ЛАЛ- теста

1

2

4

8

0,5λ

0,25λ

4

4

4

4

D

Вода для

ЛАЛ-теста

-

-

-

2

Растворы С – серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (проверка чувствительности ЛАЛ-реактива).

Раствор D – Вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль). Опыт проводят, как описано в разделе Процедура анализа. Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если:

- для раствора D (отрицательный контроль) во всех повторностях получены отрицательные результаты;

- для раствора С с концентрацией 0,25λ получены отрицательные результаты.

Конечной точкой реакции для каждой из повторностей растворов С является положительный результат, полученный для раствора с наименьшей концентрацией КСЭ. По этим результатам рассчитывается среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива по следующей формуле:

Среднее геометрическое значение

концентраций КСЭ в конечной точке = antilog ( ), реакции

где Σ e – сумма логарифмов концентраций КСЭ в конечной точке реакции в каждой из повторностей, f – число повторностей.

Заявленная чувствительность ЛАЛ-реактива считается подтвержденной и используется в дальнейших расчетах в том случае, если полученное в эксперименте значение чувствительности ЛАЛ-реактива не менее 0,5λ и не более 2λ.

Мешающие факторы

Испытуемое лекарственное средство может содержать мешающие факторы, усиливающие и/или ингибирующие реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами. Обнаружить эти явления можно, сравнив способность используемого ЛАЛ-реактива реагировать с раствором КСЭ в воде для ЛАЛ-теста и в растворе испытуемого лекарственного средства в стандартных условиях проведения эксперимента.

Испытанию может быть подвергнуто лекарственное средство в любом разведении, не превышающем значения МДР. Используемые в данном анализе пробы испытуемого лекарственного средства (или его разведения) не должны содержать бактериальных эндотоксинов в определяемых в тесте количествах.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы А–D по схеме, приведенной в табл. 27.2.

Раствор А – испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении (контроль отсутствия бактериальных эндотоксинов).

Растворы В – серия разведений КСЭ в растворе испытуемого лекарственного средства (выявление возможности ингибирования или усиления реакции).

Растворы С – серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива).

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Таблица 27.2

Схема эксперимента «Мешающие факторы»

Раствор

Исходный раствор

Растворитель

Фактор разведения

Конечная концентрация эндотоксина

в испытуемом растворе

Количество повторностей

A

Испытуемое лекарственное средство

-

-

-

4

B

Испытуемое лекарственное средство, содержащее КСЭ

в концентрации 2λ

Испытуемое лекарственное средство

1

2

4

8

0,5λ

0,25λ

4

4

4

4

С

Раствор КСЭ в воде для ЛАЛ-теста с концентра- цией 2λ

Вода для

ЛАЛ-теста

1

2

4

8

0,5λ

0,25λ

2

2

2

2

D

Вода для ЛАЛ-теста

-

-

-

2

Опыт проводят, как описано в разделе Процедура анализа.

Результаты и интерпретация. Результаты эксперимента считаются достоверными, если:

- для раствора D получены отрицательные результаты во всех повторностях;

- для растворов С (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5λ и не более 2λ;

- для раствора А получены отрицательные результаты во всех повторностях. По результатам, полученным для каждой из повторностей растворов В, рассчитывают среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива. Расчет проводят, как описано в разделе Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива. Если полученное среднее значение оказалось не менее 0,5λ и не более 2λ, испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении не содержит мешающих факторов, способных ингибировать и/или усиливать реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами, и может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Если присутствие мешающих факторов обнаружено для испытуемого лекарственного средства, которое проверялось в разведении, меньшем МДР, анализ повторяют в большем разведении, вплоть до разведения, равного МДР. В большинстве случаев дополнительное разведение испытуемого лекарственного средства способно снять действие мешающих факторов. Использование ЛАЛ-реактива большей чувствительности позволяет увеличить степень разведения.

Действие мешающих факторов может быть преодолено соответствующей обработкой, например, фильтрацией, нейтрализацией, диализом или температурной обработкой. Выбранный способ удаления мешающих факторов не должен изменять концентрацию бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, поэтому КСЭ к раствору испытуемого лекарственного средства добавляют перед проведением такой обработки, после чего проводят анализ Мешающие факторы. Если после обработки выбранным способом результаты анализа Мешающие факторы окажутся удовлетворительными, то испытуемое лекарственное средство может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Если испытуемое лекарственное средство нельзя освободить от мешающих факторов, оно не может быть исследовано на предмет содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛ-теста.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (МЕТОД А)

Задачей этого анализа является подтверждение того, что содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце не превышает значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в частной фармакопейной статье.

Анализ проводят с лекарственным средством в одном разведении, в котором был проведен анализ Мешающие факторы, или в большем разведении, но не превышающем значения МДР.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы А–D по схеме, приведенной в табл. 27.3.

Раствор А – испытуемое лекарственное средство в разведении, в котором отсутствуют мешающие факторы, или в большем разведении, не превышающем МДР.

Раствор В – испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении, к которому добавлен КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2λ (положительный контроль испытуемого лекарственного средства).

Раствор С – раствор КСЭ в воде для ЛАЛ-теста с конечной концентрацией 2λ (положительный контроль).

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль). Анализ проводят, как описано в разделе Процедура анализа.

Таблица 27.3

Схема эксперимента «Качественный анализ»

Раствор

Исходный раствор

Конечная концентрация эндотоксина (КСЭ)

в испытуемом растворе

Количество повторностей

А

Испытуемое лекарственное средство

-

2

В

Испытуемое лекарственное средство, содержащее КСЭ в концентрации 2λ

2

С

Раствор КСЭ в воде

для ЛАЛ-теста с концентрацией 2λ

2

D

Вода для ЛАЛ-теста

-

2

Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если:

- для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в обеих повторностях;

- для раствора С (положительный контроль) во всех повторностях получены положительные результаты;

- для раствора В (положительный контроль испытуемого образца) в обеих повторностях получены положительные результаты.

Если для раствора А в обеих повторностях получены отрицательные результаты, лекарственное средство считают выдержавшим испытания.

Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, меньшем МДР, в обеих повторностях получены положительные результаты, анализ следует повторить в разведении, равном МДР.

Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, равном МДР, в обеих повторностях получены положительные результаты, то лекарственное средство не соответствует требованиям раздела «Бактериальные эндотоксины» частной фармакопейной статьи.

Если положительный результат получен в одной из повторностей для раствора А, то проводят повторный анализ. Лекарственное средство считается выдержавшим испытания, если в повторном анализе для обеих повторностей получены отрицательные результаты.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (МЕТОД В)

Задачей этого анализа является определение содержания бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве. Для этого используется серия последовательных разведений испытуемого лекарственного средства, начиная с того разведения, для которого был проведен анализ Мешающие факторы, или большего, но не превышающего МДР.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы A–D по схеме, приведенной в табл. 27.4.

Растворы А – разведение испытуемого лекарственного средства, начиная с разведения, в котором отсутствуют мешающие факторы, до наибольшего разведения, не превышающего МДР.

Раствор В – испытуемое лекарственное средство в наименьшем из проверяемых в тесте разведений, к которому добавлен раствор КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2λ (положительный контроль испытуемого лекарственного средства).

Растворы С – серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива).

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль). Анализ проводят, как описано в разделе Процедура анализа.

Таблица 27.4

Схема эксперимента «Количественный анализ»

Раствор

Исходный раствор

Растворитель

Фактор разведения

Конечная кон- центрация КСЭ в испытуемом растворе

Количество повторностей

А

Испытуемое лекарственное средство

Вода для

ЛАЛ-теста

1

2

4

8

и т.д. до МДР

-

-

-

-

2

2

2

2

В

Испытуемое лекар- ственное средство, содержащее КСЭ

в концентрации 2λ

Испытуемое лекарственное средство

1

2

С

Раствор КСЭ

в воде для ЛАЛ-теста с концентрацией 2λ

Вода для

ЛАЛ-теста

1

2

4

8

0,5λ

0,25λ

2

2

2

2

D

Вода для ЛАЛ-теста

-

-

-

2

Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если:

- для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в обеих повторностях;

- для растворов С (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5λ и не более 2λ;

- для раствора В (положительный контроль испытуемого образца) получены положительные результаты в обеих повторностях;

- для растворов А конечной точкой реакции является положительный результат, полученный для наибольшего разведения испытуемого лекарственного средства.

Значение произведения фактора этого разведения на величину чувствительности ЛАЛ-реактива (λ) равно концентрации эндотоксина в растворе А, полученной для данной повторности. Среднее геометрическое значение концентрации эндотоксина рассчитывают, как описано в разделе Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива.

Если во всех повторностях серии растворов А получены отрицательные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве менее чувствительности ЛАЛ-реактива, умноженной на наименьший фактор разведения.

Если во всех повторностях серии растворов А получены положительные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве более чувствительности ЛАЛ-реактива, умноженной на наибольший фактор разведения.

studfiles.net

ЛАЛ-ТЕСТ, ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ — Pyrogenicity

ЛАЛ-ТЕСТ, ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ.

ЛАЛ-тест для определения пирогенности лекарственных препаратов является активно развивающимся в настоящее время способом контроля качества лекарственных средств. Он может быть использован и в некоторых других областях, где необходимо быстрое обнаружение грамотрицательных бактерий или их эндотоксинов. В основе этого теста лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий (липополисахаридами, ЛПС). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина.

Реакция лизата амебоцитов с эндотоксином была открыта в США в 1964 году, где и был налажен выпуск первых коммерческих препаратов. Поскольку первые исследования были проведены на мечехвостах вида Limulus polyphemus, препарат, полученный из их крови, был назван Лизат амебоцитов Limulus (Limulus amebocyte lysate), сокращенно ЛАЛ-реактив и, соответственно, ЛАЛ-тест.

ЛАЛ-тест считается сегодня наиболее надежным и перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных средств. Преимущества этого теста: высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, воспроизводимость, возможность получения количественного ответа. К несомненным преимуществам ЛАЛ-теста относится возможность анализировать в короткий срок большое число образцов. При массовом использовании ЛАЛ-тест, безусловно, дешевле теста на кроликах. Кроме того, этот метод дает возможность проводить постадийный контроль содержания эндотоксинов в процессе производства инъекционных препаратов.

Пирогены и эндотоксины

Термин «пироген» происходит от греческого “pyreto” – лихорадка. Пирогенами называют вещества, способные вызывать повышение температуры тела. Пирогенную реакцию способны вызывать вещества самой различной природы и разного происхождения. К пирогенам можно отнести грамотрицательные бактерии и их токсины, грамположительные бактерии и их токсины, вирусы и продукты их жизнедеятельности, а также стероиды и пр. В области контроля качества инъекционных лекарственных средств практическое значение имеют бактериальные эндотоксины, которые являются фрагментами внешней стенки грамотрицательных бактерий.

Грамотрицательные бактерии обладают двуслойной клеточной стенкой, которая окружает цитоплазматическую мембрану. Первый слой — очень тонкая (толщиной 1 нм) нелипидная мембрана, состоящая из пептидогликана. Его называют также гликопептидом или мукопептидом. Это сложный матрикс, содержащий полисахаридные цепи, связанные друг с другом поперечными сшивками из коротких пептидных цепей. Второй слой клеточной стенки — липидная мембрана толщиной 7,5 нм. Именно на этой внешней мембране и расположены эндотоксины (липополисахариды). Молекулы эндотоксина обеспечивают структурную целостность, отвечают за многие физиологические функции, в том числе определяют патогенные и антигенные свойства бактерий. Структурно молекула эндотоксина делится на три части – Липид А, Кор и О-специфическую цепь.

Липид А состоит из дисахарида, фосфата и жирных кислот. Жирные кислоты, входящие в состав Липида А, могут быть насыщенными и ненасыщенными. Наиболее часто в состав Липида А входят кислоты: пальмитиновая, лауриновая, глутаминовая, меристиновая. Участок Липида А является наиболее константным участком молекулы ЛПС, и его строение схоже у многих бактерий.

О-специфическая цепь липополисахаридов построена из повторяющихся олигосахаридов. Наиболее распространенными сахарами, входящими в состав О-специфической цепи, являются глюкоза, галактоза, рамноза. Этот участок молекулы придает ей гидрофильные свойства, благодаря которым ЛПС хорошо растворимы в воде. Полисахаридная часть является наиболее вариабельной частью молекулы ЛПC. Часто этот фрагмент молекулы называют О-антигеном, так как именно он отвечает за антигенную активность грамотрицательных бактерий.

Кор — центральная часть молекулы, связывающая О-антиген с Липидом А. Формально структура кора подразделяется на внешнюю и внутреннюю части. В состав внутренней части кора обычно входят остатки L-глицеро-О-манногептозы и 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО). КДО содержит 8 атомов углерода и в природе практически нигде больше не встречается.

Кроме липополисахаридов в состав внешней стенки грамотрицательных бактерий входят и белки (внешняя мембрана на ¾ состоит из ЛПС, и только ¼ приходится на белковые компоненты). Эти белки вместе с ЛПС образуют белково-липополисахаридные комплексы разного размера и молекулярной массы. Именно эти комплексы и называютсябактериальными эндотоксинами. Очищенные препараты, которые используются в качестве стандартов, лишены пептидных фрагментов и представляют собой чистый препарат липополисахарида. Тем не менее, термин «бактериальные эндотоксины» применяется с равным успехом и к естественным эндотоксинам, оказавшимся в растворе в результате разрушения бактерий, и к чистым препаратам ЛПС.

На внешней стенке одной грамотрицательной бактерии может содержаться до 3,5 млн. молекул ЛПС. После ее гибели все они оказываются в растворе. Эндотоксины грамотрицательных бактерий остаются биологически активными молекулами и после гибели бактерий. Молекула эндотоксина температуростабильна и легко выдерживает цикл стерилизации в автоклаве. Малые размеры молекул эндотоксинов позволяют им легко проходить через мембраны, используемые для стерилизации растворов (0,22 мкм). Поэтому эндотоксины могут присутствовать в готовых лекарственных формах, даже произведенных в асептических условиях и прошедших финишную стерилизацию.

Бактериальные эндотоксины являются исключительно активными (сильными) пирогенами. Для развития лихорадочного приступа достаточно присутствия бактериальных эндотоксинов в инфузионном растворе в концентрации 1 нг/мл (около 10 ЕЭ/мл). Другие пирогены менее активны, и для развития пирогенного ответа их концентрация должна быть в 100-1000 раз больше. Обычно термины «пирогены» и «эндотоксины» употребляются как синонимы и, хотя не все пирогены являются эндотоксинами, наиболее значимыми являются именно эндотоксины грамотрицательных бактерий.

Природа реакции

По современным представлениям в лизате амебоцитов находятся, как минимум, три фермента и белок-субстрат. Ферменты находятся в форме предшественников, первый из них, Фактор С, способен специфически связываться с эндотоксинами. Он переходит в активную форму: активный Фактор С. Активный Фактор С переводит в активную форму следующий фермент: Фактор В. Последний в ряду ферментов, профермент, и его активная форма: свертывающий фермент. Свертывающий фермент перерабатывает субстрат: коагулоген. Молекула коагулогена разрезается на несколько полипептидных цепей, между которыми затем образуются связи, в результате чего получается пространственная структура геля.

Ферменты, составляющие систему свертывания мечехвостов, являются сериновыми протеазами, очень похожими на факторы свертывания крови у млекопитающих. То же самое можно сказать и о субстрате, не случайно название коагулоген сходно с названием белка субстрата в системе коагуляции млекопитающих: фибриногеном.

Для активации ферментной системы, точнее первого фермента в каскаде, Фактора С, нужны минимальные концентрации бактериальных эндотоксинов.

В основе всех методов оценки концентрации эндотоксинов лежит измерение степени активации ферментной системы, хотя способы измерения её активности могут быть различными. Концентрация эндотоксина может быть определена путем оценки количества переработанного субстрата (естественного или искусственного) за определенный промежуток времени: анализы по конечной точке. Она также может быть определена путем оценки времени, необходимого для переработки определенного количества субстрата (точнее по определению скорости этой переработки): кинетические анализы.

В естественной ситуации свертывающий фермент разрезает коагулоген на несколько фрагментов, которые затем полимеризуются. В результате реакции с прозрачной реакционной смесью происходят изменения, которые выражаются в помутнении содержимого, образовании вязких гелевых масс и, в конце концов, в образовании твердого геля. Гель, образующийся в результате реакции, удерживается в виде плотного опалесцентного сгустка на дне пробирки при ее переворачивании на 180°. Такой наиболее простой способ оценки активности ферментной системы называется гель-тромб тест.

Процессу образования геля предшествует процесс полимеризации субъединиц коагулина, который сопровождается помутнением реакционной смеси. Степень этого помутнения может быть измерена фотометрически. Чем выше концентрация эндотоксина, тем активнее ферментная система, тем меньше надо времени для переработки субстрата, тем быстрее идет реакция. Метод, в котором результат реакции определяется по степени этого помутнения, называется турбидиметрическим тестом.

Пожалуй, наиболее интересным способом измерения активности ферментной системы является хромогенный тест. Для проведения этого анализа используется специальный ЛАЛ-реактив, в котором коагулоген заменен на искусственный хромогенный субстрат. Хромогенный субстрат представляет собой простой полипептид с хромофором на конце. Последовательность аминокислотных остатков в полипептиде аналогична аминокислотной последовательности коагулогена, предшествующей связи, разрезаемой свертывающим ферментом. Активный свертывающий фермент отрезает хромофор от пептидной цепи, и в растворе развивается желтое окрашивание. Интенсивность окраски пропорциональна активности свертывающего фермента, которая в свою очередь определяется количеством эндотоксина в растворе. Интенсивность окраски также измеряется фотометрически.

Кинетические методы позволяют проводить точное количественное определение концентрации эндотоксина в растворе. Они позволяют во многом стандартизировать и автоматизировать процесс проведения реакции. Важным считается и тот факт, что автоматическая обработка и хранение результатов снижают риск получения ошибки, связанной с человеческим фактором.

Понравилось это:

Нравится Загрузка...

Похожее

iosadpiro.wordpress.com

Mикробиологический мониторинг воды « Российская Фармацевтика

На всех фармацевтических предприятиях производится постоянный контроль качества используемой воды. Отбор проб и их анализ являются неотъемлемой частью системы отслеживания качества воды, которая была создана на основании проведенных валидационных испытаний. Объектами контроля являются:

 

  • вода питьевая как материал для получения воды очищенной. В основном проверяется сторонними организациями, например, водоканалом.
  • вода очищенная – вода, полученная дистилляцией, обратным осмосом, деионизацией, ультрафильтрацией или комбинацией перечисленных методов, используемая в нестерильном фармацевтическом производстве.
  • вода для инъекций, полученная дистилляцией в несколько этапов и предназначенная для растворения лекарственных веществ перед фильтрацией и для последнего ополаскивания первичной тары фармацевтической продукции, приготовляемой асептически.

Отбор проб

  • Отбор проб проводится в определенных точках
  • Пробы должны отбирать обученные работники, метод отбора проб должен быть задокументирован
  • Пробы воды для проведения микробиологических анализов должны помещаться в стерильную тару
  • Пробы воды в тот же день должны быть проанализированы в микробиологической лаборатории
  • Пробы для определения эндотоксинов должны отбираться в специальную апирогенную тару
  • Порядок пробоотбора – микробиология, эндотоксины, химический разбор, остальные анализы

Предельно допустимые показатели для исследуемой воды

WFI – вода для инъекций

Микробиологическая чистота – предельно допустимый показатель по Фармакопее – 10 КОЕ /100 мл (пример лимита действия – 1 КОЕ/100 мл)

Эндотоксины – макс. 0,25 МЕ / мл

PW – вода очищенная

Микробиологическая чистота – предельно допустимый показатель по Фармакопее – 100 КОЕ/1 мл (пример лимита действия – 30 КОЕ / мл)

Эндотоксины – макс. 0,25 МЕ/ мл

Лимиты тревоги и действия (для воды WFI и PW) устанавливаются на основании годового тренда на год вперед индивидуально для каждого производства. Если имеется несколько контуров воды, лимит действия устанавливается для каждого контура отдельно.

Микробиологическое определение

Определяется общее количество микроорганизмов в пробе установленного объема. Методикой первого выбора является фильтрование. В случае, если предполагается обнаружение большего количества микроорганизмов в воде, можно использовать альтернативный метод культивации пробы на агаровой среде.

Установление общего количества микроорганизмов – метод фильтрования.

  • Используется стерильная фильтровальная аппаратура со стерильным мембранным фильтром с размером пор 0,45 ?м.
  • Фильтрация проводится в контролируемой среде с использованием вакуумного насоса или центрального вакуума.
  • Установленное количество контролируемой воды переливается в фильтровальное оборудование на мембранный фильтр, жидкость отфильтровывается, а мембранный фильтр при помощи стерильного пинцета переносится на поверхность агаровой среды.
  • Количество воды для контроля – 200 мл воды для инъекций, 10 мл воды очищенной. Если ожидается высокое содержание микроорганизмов в воде очищенной, пробу необходимо перед анализом разбавить стерильной водой в соотношении 10x .
  • Для установления общего количества бактерий в воде используется агаровая среда, предусмотренная Фармакопеей, способная поддерживать рост широкого спектра микроорганизмов (проводится подтверждающий анализ ростовых свойств)
  • Инкубация фильтра на агаровой среде проходит в течение 5 дней при температуре 30 – 35°C.

Для фильтрации можно использовать оборудование Milliflex с одноразовыми простерилизованными фильтрами и воронками.

Установление общего количества микроорганизмов – метод подсчета на агаровой среде

  • Стерильной пипеткой переносится по 1 мл анализируемой воды на 3 чашки Петри (? 9 см) с агаровой средой.
  • Инкубирование, как и при фильтрационном методе.

Определение специфических микроорганизмов

Данная проверка не является обязательной, проводится для воды очищенной и устанавливает содержание Pseudomonas aeruginosa путем инкубации на цетримидовой агаровой среде. Это наиболее частый индикатор загрязненности фармацевтических вод.

Определение эндотоксинов

Основная информация

Бактериальные эндотоксины представляют собой липополисахариды (ЛПС) клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Высвобождение ЛПС происходит после прекращения жизнедеятельности и аутолиза клетки.

Бактериальные эндотоксины имеют пирогенные свойства, т.е. при внутривенном введении вызывают повышение температуры тела и другие нежелательные реакции вплоть до шока и летального исхода.

Бактериальные эндотоксины составляют более 90% всех эндотоксинов. К пирогенам небактериальной природы относятся вирусы, грибки, антигены или синтетические адъюванты. С учетом опасности бактериальных эндотоксинов и трудности их удаления (химического и физического) из зараженного лекарственного препарата, необходимо принимать меры к минимизированию риска контаминации на фармацевтическом производстве.

Источниками бактериальных эндотоксинов на производстве лекарственных средств являются вода, персонал, некоторые виды сырья. Поэтому особое внимание уделяется проверке отсутствия эндотоксинов в воде на разных этапах ее получения. С учетом вышеизложенного устанавливают содержание эндотоксинов в воде для инъекций, используемой для производства парентеральных препаратов, и в воде очищенной, используемой в производстве субстанций для последующего приготовления парентеральных препаратов.

Существует два основных метода определения эндотоксинов

  1. Определение пирогенности на кроликах – установление всех пирогенов, включая эндотоксины
  2. ЛАЛ тест (Limulus Amebocyte Lysate Test) – устанавливает эндотоксины (не пирогены как таковые)

ЛАЛ тест

ЛАЛ тест является «in vitro» методом, основанным на свойствах амебоцитов гемолимфы мечехвостов. Наиболее часто встречающимся представителем мечехвостов является Limulus polyphemus, от которого и произошло название реактива. Из амебоцитов приготовляется очищенный лизат, который используется для определения бактериальных эндотоксинов.

Принцип метода:

Бактериальный эндотоксин активирует в присутствии двухвалентных ионов (Ca, Mg) фактор B, содержащийся в лизате. Это дает начало каскадной реакции, в результате которой образуется гель.

Фактор B Эндотоксин Активированный фактор B

Проэнзим Активированный фактор B Коагуляционный энзим

Коагулоген Коагуляционный энзим Коагулин + гель

Типы ЛАЛ теста

  • Гелевый метод (оценивает возникновение геля, принцип лимитный или кинетический)
  • Турбидиметрический метод (оценивает возникновение помутнения, принцип конечной точки «end-point» и кинетический)
  • Хромогенный метод (оценивает возникновение окрашивания, принцип «end-point» и кинетический)

Гелевая методика является методикой первого выбора для определения эндотоксинов в воде.

Приготовление реактивов проводится согласно инструкции производителя набора (лизат + эндотоксин).

Лизат ЛАЛ

Лизат используется для установления эндотоксинов в неизвестных пробах. Чувствительность лизата обозначается буквой ? и указывается на каждом флаконе с лизатом.

Для фармацевтической воды (WFI или PW) максимально допустимое содержание составляет 0,25 МЕ/мл. В основном для установления данного лимита используется лизат с высокой чувствительностью ?=0,125.

Стандартный эндотоксин

Эндотоксин из набора используется для подтверждения приведенной чувствительности лизата, для валидации лабораторного метода и для приготовления ППК (позитивного продуктового контроля). Сила эндотоксина выражается в МЕ/мл или ЭЕ/мл. (МЕ – международная единица, ЭЕ – эндотоксиновая единица).

Эндотоксин растворяется в непирогенной воды согласно инструкции производителя таким образом, чтобы получился ряд 4, 2, 1, 1/2 и 1/4?, т.е. две более и две менее чувствительные концентрации, чем приведенная чувствительность ?.

Пробы

Подготавливается ряд проб согласно таблице:

Раствор Исходная концентрация эндотоксина в растворе, в который был добавлен эндотоксин Количество пробирок
A Нулевая / исследованный образец воды 2
B 2 ?/ исследованный образец воды – ППК – позитивный продуктовый контроль 2
C 2 ?/ вода для ЛАЛ – позитивный контроль 2
D Нулевая / вода для ЛАЛ – негативный контроль 2

Непосредственное определение

  • В пробирки вносится по 0,1 мл приготовленных растворов
  • Ко всем вышеперечисленным пробам добавляется по 0,1 мл растворенного лизата ЛАЛ
  • Реакционная смесь смешивается и инкубируется в течение 60 минут при 37±1°C. После окончания реакции отсчитывается результат

Оценка теста

Пробирки осторожно переворачиваются на 180° и отслеживается образование геля

  • Позитивная реакция – гель густой, не стекает по стенкам
  • Негативная реакция – жидкий гель, жидкость

Результат считается удовлетворительным, если:

  • Ни в одной из пробирок с растворами A и D (негативный контроль и пробы) не произойдет реакция
  • В растворе C подтвердится указанная чувствительность лизата (позитивный контроль)
  • В растворе B не установлена чувствительность лизата менее 0,5 ? (0,06 МЕ/мл) и более 2 ? (0.25 МЕ/мл) – исследуемый раствор в данных условиях не содержит интерферирующие факторы и не влияет на добавленный эндотоксин.

Яна Гаклова (Jana Haklov?), доктор наукэксперт компании FAVEAИсточник: favea.org

pharmapractice.ru


Смотрите также